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[關鍵詞] 高職 藥理學 教學方法 改革探討
藥理學是一門研究藥物與機體之間相互作用規律的一門科學，也是藥學與醫學之間的橋梁和紐帶。學生通過學習和掌握藥理學的基本理論、基本知識和基本技能，指導臨床合理用藥，開發新藥和老藥新用途，并為制藥工程的發展提供理論依據。學習藥理學的主要目的是使學生理解藥物的作用、作用機制、臨床應用以及不良反應，掌握藥物的有效性、安全性及應用合理性。
藥理學內容繁多復雜，理論抽象枯燥，學生不易理解，同時傳統的藥理學教學只是單一的課堂講授， 同時傳統的藥理學教學只是單一的課堂講授，教師通過語言、文字等向學生傳達信息、面授知識，這種教學方法單調、乏味、空洞，學生死記硬背、生搬硬套、負擔沉重，處于被動狀態。由于藥理學是高速發展的學科之一，新的藥物不斷出現，新的理論和治療方法不斷出現，加之藥名繁多，且不易記憶。因此如何使學生變被動吸取知識為主動學習知識，引導和培養學生的獲取和歸納藥理知識，靈活運用藥理知識的能力，是藥理學教學改革的重點，對培養高素質制藥人才具有重要意義。
1 理論教學方法改革
合理地使用多種教學方法。一般采用多媒體教學課件結合板書，以系統性講授為主，引導學生全面了解、把握藥理學基本知識、基本理論、基本方法；在課堂授課過程中，貫穿啟發式教學理念，不斷提出能促進學生思考引起學生重視的問題，激發學生的學習興趣，加深學生的所學內容的理解，并提高學生的科學素養。為了提高學生學習的積極性，如果條件可以，適當制作些簡單的動畫，使藥物作用機制的抽象內容變得生動形象，易于學生接受。
同時，為培養學生積極主動地學習知識，歸納知識和靈活運用知識的能力，還可以開展“問題式學習”的教學模式。由一名教師指導10-20名學生，針對典型病例和藥理學習中的疑難問題組織討論。上課90分鐘內，前20分鐘，教師做好課題內容介紹，并準備好有針對性的思考問題，經過10分鐘思考準備，學生按照小組為單位發言（大概40分鐘），其間老師作必要的引導和補充，最后20分鐘教師對每個發言進行總結、點評[1]。該教學模式既調動了學生的學習積極性，促進了基本理論和基本知識的學習，同時充分發揮學生的主體性，增強學生自學能力、分析和解決問題的能力，以及團隊合作精神。
2 實踐教學改革
藥理學實驗課中不乏經典實驗，對這部分實驗內容實驗目的要明確，教師所提出的問題應該是啟發式的，同時切忌包辦所有“問題”的設定，應該鼓勵學生在分析教師設定的問題情景的基礎上提出問題，并在教師的幫助下完成問題的解答，當然，問題的提出都應該圍繞實驗目的來完成。在實驗結果的分析方面，應指導學生查閱相關文獻和資料，鼓勵學生大膽提出自己的看法。當然，藥理學實驗教學最好采用先進的生理藥理實驗微機教學系統，實現實驗參數的統一性, 實驗結果的平行性, 同時規范了學生的實驗操作，實驗結果隨時可以存盤、讀取和打印, 提高實驗教學質量和安全性，提高學生對實驗的興趣。
3 教學手段改革
在科技高度發展的今天，教學手段日新月異。現在，我們基本停用了板書、掛圖等手段，而以多媒體課件為主要手段進行教學，看標本、看錄像、看臨床上常用代表藥物藥品說明書等方法幫助學生更加了解藥理學專業知識，掌握扎實的藥理學知識，提高學習成績，收到非常好的教學效果，也受到同學們的好評。對重要的的概念和代表藥以教師講授為主，盡可能講深、講透；對其它同類藥的特點讓學生討論并列表比較或自學，刪去教材中臨床已很少使用的藥物，增加部分教材中沒有而臨床常用的新藥。注意調動學生學習積極性，指定自學參考書并布置一些課后思考題，督促學生進行自主學習。定期開展形成性評價，如提問、小測驗、批改作業和實驗報告等。
多媒體輔助教學能夠充分利用色彩、動畫、聲音、圖形等形式，以直觀、新穎、活動的圖像和畫面展示教學內容。這種信息的表達形式具有很強的吸引力，可以讓學生通過多個感覺器官來獲取信息，最大限度地接收信息。藥理學需要背誦記憶、抽象理解的內容很多，在學習過程中會顯得枯燥乏味而導致厭學情緒。多媒體教學的優點是可以將動態影像、圖片色彩、文字聲音等各種信息緊密地結合在一起，提供圖文并茂、聲像俱佳、動靜結合、新穎逼真的教學內容。特別是利用多媒體造成的視覺、聽覺刺激，充分調動了學生學習的主動性，大大激發了學生的學習興趣。例如通過觀看具體藥物口服的吸收過程，使學生非常形象地掌握了何謂“首關消除”以及首關消除顯著的藥物可以采用舌下含服的給藥途徑等比較抽象的概念，這樣不僅加深了學生對所學知識的理解與記憶，也有助于知識要點的記憶保持，同時也可節約教師在傳統教學模式中板書繪圖的時間。另外，通過多媒體教學還可以展現板書教學無法演示的宏觀和微觀世界，使學生能更好地掌握教學內容。例如在講授“抗心律失常藥物”時，教師一般先要復習生理學中心臟電生理的有關內容，并講解心律失常發生的機制，因為這些往往都是學生學習的難點[2]。可以采用多媒體教學，利用動畫，通過直觀的心肌電生理圖像的展示和動態對比，引導學生比較、總結，這樣可以使學生高效而牢固的掌握知識，同時多方面提高學生能力。利用多媒體技術信息量大、多渠道的特點，可以擴大課時容量，豐富教學內容。
4 考試方式的改革
考試是檢查學生學習成果和教師教學效果的重要方式，是學生學習成績的階段性、總結性的檢查與評定。藥理學理論考試應做好有目的的要求，對于高職制藥專業學生，偏向使用開卷考試的形式，考試內容要偏向于新藥知識或藥物新的使用方法等，讓學生掌握今后制藥發展的趨勢。實踐考試要求學生掌握基本的藥理實驗技術。改革考試題型，部分題型參照執業醫師、藥師、公共衛生醫師等資格考試題型。及時更新試題庫，考前自動組卷，實行教考分離。
參 考 文 獻
關鍵詞：血清藥理學；腫瘤；細胞凋亡； 三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶
中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A
文章編號：1673-7717(2008)05-1108-02
Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity
CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1
（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）
Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.
Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase
20世紀80年代中期，日本學者Iwama H等率先提出“血清藥理學方法”。此法是先給動物灌胃給中藥，一定時間后再采集、分離其血清，并用此含藥血清進行體外實驗[1]。血清藥理學方法已被廣泛用于中醫藥作用機制的研究，研究層面已涉及到細胞增殖、分化、凋亡與細胞周期的調節以及基因表達等方面。本研究采用治療胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌等中藥血清學方法，深入探討其誘導腫瘤細胞凋亡、降低腫瘤細胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)與葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。
1 實驗方法
1.1細胞培養主要試劑 抗肝癌、胃癌、肺癌、大腸癌等不同中藥復方中的中藥，均由遼寧中醫藥大學第一附屬醫院提供。
1.2中藥制劑制備 將3個不同中藥復方組成后傳統煎制：中藥清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，紗布過濾取汁，藥渣加水再煎20min，兩次藥汁混合，濃縮為100%。
1.3藥物血清制備 動物：SD大鼠由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供。30只SD大鼠隨即分為3組，即中藥組10只，化療組10只，對照組10只。實驗前禁食12h，采用2次給藥方法（第1次給藥2h后重復等量給藥1次），每100g大鼠灌胃中藥制劑1mL，2次/日連續灌胃3天。化療組、對照組生理鹽水等量灌胃3天。分別在末次給藥后1、2、3h采血，戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下，下腔靜脈取血，靜置4h，4℃，3000r/min 20min離心，分離血清，同種條件藥物血清混勻，過濾，56℃30min滅活，-20℃保存，備用。
血清分組：中藥血清組（中藥組）、化療血清組（西藥順鉑-DDP組）、對照血清組（對照組）。（1）中藥血清組：臨用前將中藥組大鼠血清加入PRMI1640培養液，濃度分別為5%、10%、20%。（2）化療血清組：用含10%化療組大鼠血清PRMI1640培養液，DDP的終濃度為5%、10%、20%。（3）對照血清組：大鼠血清中加入PRMI1640培養液，終濃度為5%、10%、20%。
1.4細胞株 肝癌細胞株、SGC7901胃癌細胞株、細胞株 A549人肺癌細胞株和CCL229人大腸癌細胞株和均由中國醫科大學生物教研室衛生部重點實驗室提供。
2細胞培養
將細胞從凍存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min內融化，無菌條件下打開安瓶，接種于2只無菌培養瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培養液，在5%CO2，37℃條件下CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態，24h后見細胞貼壁生長狀態良好，棄培養液，分別加入各組血清，繼續培養。
3標本制備
3.1細胞凋亡 生長在培養瓶內的貼壁細胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮鏟刮下細胞，轉至離心管內，低溫高速離心機2000r/min，15min，瓊脂處理成塊，PBS沖洗，1%鍔酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，超薄切片機（LKB-V）切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡（JEM-1200）觀察、攝片。
3.2酶細胞化學 取出培養皿中的載片，PBS沖洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脫水，3次×30min，分別加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，雙蒸水沖洗，2min×3次，2%硫化銨成色，2min，雙蒸水沖洗，2min×3次，梯度乙醇脫水各10min，甘油明膠封片，普通光鏡下觀察、拍片。
4 結果
4.1 細胞凋亡 ①正常對照組：各組腫瘤細胞株多為長梭形，表面可見較多的微絨毛，線粒體、粗面內質網、高爾基復合體、溶酶體等細胞器豐富、排列規則。②中藥組：細胞表為橢圓形、圓形。表面微絨毛明顯減少、消失。胞漿濃縮，可見大小不等的空泡，泡內容物電子密度與機制相似。細胞核變小、不規則，染色質濃縮、邊集，呈斷裂狀，部分線粒體腫脹、空泡化。可見到典型的凋亡小體：圓形，可見從凋亡細胞脫落。位于凋亡細胞一側，表面有完整的細胞膜包裹，小體內可見染色質碎片及破碎的內質網、囊泡化的線粒體等結構。③化療組：結果與中藥組相似，可見典型的凋亡小體。
4.2 酶細胞化學 ①Mg2+-ATP酶：光鏡下可見對照組細胞Mg2+-ATP酶主要定位在細胞膜內側，黑色酶反應顆粒大小均勻，密度大，呈線狀規則排列，酶活性強。與正常組比較，中藥組、西藥組細胞的酶反應顆粒變小，數量減少，密度減低。提示酶活性明顯下降。②G-6-P酶：光鏡下可見對照組細胞的G-6-P酶主要定位在細胞質內，酶反應顆粒粗大，排列密集，呈融合狀，酶活性強。與對照組比較，中藥組、西藥組細胞的酶反應顆粒變小，數量減少，密度減低，西藥組部分細胞為陰性。提示酶活性明顯下降。 采用Tiger圖像分析儀測定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶陽性細胞平均光密度（AOD）值，與對照組相比，P＜0.01。
5 討論
中藥血清藥理學方法是由日本學者于20世紀80年代首先提出來的。是給動物灌服中藥一定時間后，取其血清進行實驗的藥理學研究方法。利用血清藥理學方法，給大鼠灌服中藥一定時間后，取出血清進行體外實驗。能客觀反映中藥進入體內之后，經過消化、吸收、代謝等過程后發揮藥效作用，中藥血清藥理學提示：中藥復方誘導的腫瘤細胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。
本研究證實，4種不同中藥復方的中藥血清，均能誘導相應肝癌細胞株、A549人肺癌細胞株、CCL-229人大腸癌細胞株和SGC-7901胃癌細胞株發生凋亡，見到典型的形態學特征性指標――凋亡小體[3-4]。
Mg2+-ATP酶是質膜標志酶，主要定位于細胞膜內側，此酶參與質膜上離子的主動轉運，,維持細胞內K+和Na+濃度相對穩定狀態,保持細胞膜內、外滲透壓平衡以及參與保持細胞內外的化學梯度和跨膜電位，維持細胞內高鉀低鈉狀態，從而保證細胞的活性。本實驗中，藥物血清作用后細胞的酶反應顆粒變小，數量減少，密度減低，提示酶活性明顯下降。G-6-P酶是內質網標志酶，是一種多功能酶,是細胞內糖原異生作用中重要酶之一，被稱為“代謝標志酶”之一。此酶在糖代謝、免疫球蛋白合成及其它蛋白質合成、濃縮、加工等方面發揮重要作用。本實驗中，藥物血清作用后細胞的酶反應顆粒變小，數量減少，密度減低，有的為陰性。提示酶活性明顯下降[5-6]中藥血清誘導腫瘤細胞凋亡，降低腫瘤細胞株酶活性可能是中藥復方抗腫瘤的機理之一。筆者同樣成功應用本中藥血清藥理學技術進行了胃癌寧對人SGC-7901胃癌細胞株p53、bcl-2基因表達影響的研究[7]。
（1）給藥方案與采血時間。目前存在多種給藥方案。但一般使用灌胃方式，也可通過皮膚、黏膜、呼吸道等途徑給藥。給藥時間最短者為1天，最長者為10天；給藥次數也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。盡管已有研究表明，連續用藥5天和10天所制備的含藥血清的生物學效應是相似的，但無論哪種給藥方法都必須使藥物濃度達到相對平衡狀態。根據目前掌握的大量藥物的有效成分的藥代動力學數據，本實驗采用與多數研究者一致的即時血清在實驗前禁食12h，次日采用兩次給藥方式（一次給藥后2h等量給藥），連續灌胃3天，日兩次；采血時相，分別在末次給藥后1、2、3h采血。證明是研究中藥復方作用腫瘤細胞株較為可靠的血清藥理學方法血清[8-9]。（2）含藥血清用量。目前中藥含藥血清的濃度還沒有確切的規定，選用5 、10 和20濃度的含藥血清進行實驗所得結果的說法不一，進行細胞增殖抑制作用的實驗采用高濃度的效果好，而進行細胞增殖促進作用的實驗采用低濃度的效果好[10]，本研究采用10的平均濃度進行實驗，結果較好。當然，最佳血清濃度是因不同實驗而異的，故最好的做法是通過預實驗來確定。血清藥理學可較好地克服了中藥粗制劑直接進入體外實驗的缺點，其結果的可信度明顯優于中藥粗制劑直接用于體外實驗，不僅提示中藥制劑在胃腸內處理過程中活性成分的轉化與改變，而且有利于中藥真正有效活性部位、有效成分的發現，將有助于促進中藥藥理現代化的發展，為新藥開發奠定能基礎。本研究進一步證實，血清藥理學方法在誘導腫瘤細胞凋亡、降低酶活性等研究中的應用具有穩定性、可信性。血清藥理學方法的應用將更多的相關中藥方劑引入抗腫瘤細胞凋亡及誘導細胞凋亡方面的研究，篩選有效的中藥成分與其有效組方來達到誘導大量腫瘤細胞凋亡，揭示中藥的抗癌機理，為中藥治療腫瘤提供科學、客觀和現代的手段與方法，是今后研究的重要內容，對人類攻克腫瘤有著重大意義。
參考文獻
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關鍵詞：研究性；教學方法；獸醫藥理學
中圖分類號：G642.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）35-0087-03
以培養大學生創新精神和研究能力為目標的研究性教學已成為世界高等教育改革的趨勢。然而，目前動物醫學專業的大學生面對繁多的理論課程，多數是被動地應付，缺少主動學習意識。如何引導學生去主動學習并掌握專業知識和技能，畢業后能快速適應新形勢和未來社會經濟發展趨勢的要求，是困擾教學的主要問題之一。圍繞這個問題，有許多解決方法，其中研究性教學以學生為中心，輔以教師的指導，注重激發學生學習的主動性與積極性，既能發揮教師的主導作用，又能發揮學生的主體作用；既能培養學生的學習興趣，又能培養學生分析問題和解決問題能力；既能使學生系統掌握本學科知識，又能培養學生的臨床實踐能力和創新精神[1]。因此，特別適于動物醫學專業大學生的教學過程。本文以“獸醫藥理學”這樣一門有代表性的專業基礎課程為例，探討研究性教學模式的實際應用，以期更好地提高教學質量。
一、建立研究性教學的理念
獸醫藥理學是動物醫學專業一門重要的專業基礎課，主要任務是培養學生在臨床上合理用藥、減少不良反應，具有教學內容多、教學時數少，理論性和實踐性都很強的特點。教師上課“滿堂灌”，學生下課背課本的傳統教學模式，使學生處于一種被動的學習狀態，學生不但無法深刻理解和掌握獸醫藥理學的基本原理和知識，而且不會靈活運用和創新，收不到理想的教學效果。開展研究性教學，有利于教會學生敏銳地發現問題、主動地提出問題、積極地尋求解決問題的方法，有利于培養學生的創新意識，鍛煉和培養學生的創新能力，激發學生的學習積極性，提高學生解決實際問題的能力[2]。因此，開展研究性教學，首先要從三個方面建立研究性教學的理念。
1.教師應轉變傳統理念。在以往的教學模式中，教師是主體，對學生的關注較少。教師自己也習慣于認為自己應該知識淵博，所謂給學生一杯水，自己要有一桶水。但研究性教學是借助于問題或案例進行的一種開放性學習，不僅問題和案例對教師來說是新的，解決問題的方式、途徑也不是唯一的，教師在這個過程中也成為一個學習者。因此，教師在開展研究性教學時，應轉變自己的心態，深刻理解教師的主要作用不是回答學生提出的所有問題，而是注重培養學生解決問題的能力[3]。
2.教師應注重學生能力的培養。對于動物醫學類課程，研究性教學的主要目的應是培養學生的能力，尤其是培養學生應用知識的能力。不同教師講授同一門獸醫藥理學課程，即使采用相同的教材，其效果也不會完全相同。有些教師講授的內容，學生考完試也就忘記得差不多了，到臨床應用時仍然要去翻書，但有些教師講授的內容，學生在臨床上遇到相關的病例就會聯想起來。根本原因在于授課教師的臨床經驗、對課程的研究程度、授課方法與理念的不同。教師在進行獸醫藥理學課程教學時應注重學生運用知識能力的培養，強調不要死記硬背課本上的內容，而要與實踐相結合，引導學生應用所學理論知識解決實際問題。而研究性教學通過教師指導學生選擇和確定與課程相關的專題或病例進行研究，使學生在主動探索、積極思考、大膽實踐的研究和學習過程中，學習知識、應用知識、解決問題，從而提升學生的綜合素質，培養學生的創造能力和創新精神[1]，因此，尤其適合運用于獸醫藥理學課程教學中。
3.學生改變學習心理與學習習慣。任何的教學過程都離不開學生的參與。與傳統教學方式相比，研究性教學對學生的學習方法和學習心理提出了挑戰。研究性教學的順利進行，不僅需要教師的努力，更需要學生學習心理與學習習慣的改變。獸醫藥理學研究性教學過程從臨床病例或相關的專題開始，學生的作業沒有現成的標準答案，需要去進行調查研究，并查閱一定數量的專業文獻。對于習慣于傳統的填鴨式教學模式的學生來說，參與教學、積極思考、大膽存疑、完成沒有標準答案的作業是他們面臨的新的挑戰，而且從被動聽講到主動參與對話，學生也需要跨越心理界限。所以，在開展研究性教學時，要讓學生明白，課程學習本身不僅在于學習知識，還在于掌握學習并運用知識的能力，應學會分析問題的思路和解決問題的方法。這樣才能讓學生更充分了解自己在學習過程中的角色，激發學習熱情，真正發揮研究性教學中學生的主體作用[3]。
二、在獸醫藥理學課程中開展研究性教學的探索
1.病例分析教學。病例分析是一種將獸醫學理論知識和臨床實踐能力有機結合起來的有效方法，具有以案釋法、教學相長、注重分析、培養能力的特點，可以讓學生把課堂上學習的理論知識運用到臨床病例中，培養獸醫專業學生的思考能力、判斷能力、實踐能力及創新能力。病例的選擇與組織是病例分析教學目標能否順利實現的關鍵。我們嘗試的病例分析教學方法分為四個階段：
第一階段：在本課程實際教學活動中可以要求每一位學生到動物醫院尋找某一個或某一類典型病例，通過觀察動物醫院醫生在這些病例診療過程中的藥物使用情況，結合理論教學內容，仔細分析所用藥物的種類、應用方法、原因、效果等。在此基礎之上，通過各種途徑查閱文獻，了解目前針對該疾病的藥物治療原則、影響因素、存在問題及發展趨勢，然后提出應用藥物控制疾病的有效措施。根據以上資料，讓每一位學生撰寫完成一份某疾病治療中的藥物應用分析報告。
第二階段：教師根據學生的分析報告，按不同病例將學生分成不同的研究小組，小組成員在一起分析、討論后，將同類分析報告綜合，進行進一步的完善、整理，最后研究小組共同或指定專人撰寫病例分析報告。這樣既充分發揮了各研究小組成員的積極性和主動性，又強調了各研究小組成員的分工合作。
第三階段：匯報研究成果階段，由各小組推薦匯報人，向全班匯報研究過程和研究結果，回答來自同學和教師的提問，并盡可能讓研究小組成員都有發表自己見解和意見的機會，同時允許小組之外的學生提問并展開討論。最后由教師對研究情況進行歸納總結。這個環節重在增強學生的語言表達能力與應變能力。教師引導學生對研究病例涉及的主要問題進行總結，對研究成果進行分析歸納，并可聯系實際，對當前知識點進行深化與遷移。
第四階段：考核評定階段。由教師根據病例分析報告、匯報表現、答辯情況進行評分，各部分均制定相應的評分標準，最終對學生在本環節學習中的表現給出評價。
在這樣的病例分析教學過程中，教師不但要引導學生去思考、去爭辯，做出決策和選擇，解決特定病例中藥物選擇使用的問題，進而從中獲得某種經歷和感悟，而且要引導學生探尋特定病例的復雜過程及其背后隱含的各種因素和發展變化的多種可能性[4]。使學生通過對這些病例用藥的分析，把所學獸藥知識與真實病例系統地聯系起來，不僅激發了學生濃厚的學習、研究興趣，還使學生認識到在疾病治療過程中藥物選擇、應用的靈活性與多變性，并初步掌握一般疾病治療的原則，為他們今后合理應用獸藥解決實際問題奠定了基礎。
2.專題研究教學。專題研究教學模式是以研究組織教學，將科學研究方法和研究能力的培養融合在課程教學過程中，培養學生從事課題研究的創新能力和創新思維[4]。
培養學生的動態思維，動態地學習并運用獸醫理論知識分析、解決各種臨床實際問題是獸醫專業大學生應具備的重要素質，專題研究就是直接服務于這一素質培養的重要教學方法。通過提出課題、進行準備、開展研究、匯報評價等教學過程，可以收到很好的激發學生自主學習和積極參與的熱情、提高學生語言表達能力等教學效果。
在專題研究教學中，教師提供的課題應當富有啟發性，能引發學生深入思考。例如，我們在針對動物醫學專業學生開展的專題研究教學中，設計了“我校動物醫院中常用藥物應用主要不良反應調查？實際應用中如何避免這些不良反應的發生”“結合前一時期發生的“速生雞”事件，闡述我國現階段是否應禁止在飼料中應用抗生素作為促生長添加劑？并分析利與弊”“分析獸醫臨床用藥中聯合用藥的利與弊”“當前我國動物源性食品中獸藥殘留的種類、殘留的原因？如何有效控制”等多個課題供學生選擇。專題研究教學始終誘導和鼓勵學生發現更復雜、更深層次的問題，而問題的解決是基于已學知識的綜合運用[4]。
與病例分析教學相似，專題研究教學環節也分為四個階段：
第一階段：由學生從教師提供的若干個課題中選擇自己最感興趣的一個進行調查、分析、查閱并研究相關資料，撰寫完成專題報告。
第二至第四階段與病例分析教學相同，依然是教師根據選題的不同，將學生分成不同的研究小組，各組學生在各自研究報告基礎上組織討論，最后形成書面報告，并以口頭報告的形式完成工作任務。在完成調查分析、組織討論、討論紀要寫作、項目報告的寫作與宣講等過程中，學生亦能很好地鍛煉組織能力和交流溝通能力。
三、研究性教學方法實施中的難點
1.問題的設計。無論是病例分析教學還是專題研究教學，研究的主題均應圍繞本專業培養目標以及學生未來工作實踐所需進行設計。它們必須難度適中，不能太難或太大，否則在規定時間內難以完成；也不能太小或不具備足夠的挑戰性，否則難以引起學生的興趣。還要適當聯系本專業領域的難點和社會熱點問題，使學生能夠學以致用[4]。
2.教師對教學過程的掌控。教師對研究性教學過程有效性的把握亦是教學的難點。教師在研究性教學過程中的指導作用影響著教學過程的質量與效率，尤其是在學生剛開始嘗試運用這種新方式進行學習時，因缺乏經驗與訓練，不知道該怎么去做，這時候教師的指導作用就顯得舉足輕重。因此，教師要充分發揮引導、支持作用，而非主導作用，重點是讓學生充分發揮學習的主動性與積極性。教師的主要任務應當是精心準備，布置好研究任務，明確學習和研究的基本要求，及時解決學生在研究過程中遇到的困難和提出的問題，并引導學生對研究內容涉及的主要問題進行回答與總結，對研究成果進行分析歸納，并聯系實際，對當前知識點進行深化與遷移[5]。
3.教學的評價。由于沒有標準答案，解決問題的答案完全有可能超出教師的原有知識積累，教師在評價方案上也要花費更多的時間。同時，由于課題最后是以小組為單位完成的，對每個組員的評價也是一個難題。因此，最后學習結束時如何評價學生工作的優劣，對教師提出了比傳統教學方法更高的要求[4]。
4.不利于知識的系統性學習。病例分析教學或專題研究教學這類方式的學習是基于問題的解決，因此，所有的知識因圍繞該問題，而使知識的學習缺乏系統性和完整性。對于理論性強的基礎知識，如獸藥的作用機理、體內過程等部分內容，并不適用于研究性教學。
5.教師的投入不足。由于研究性教學過程中，教師在進行課題篩選、報告審閱、分組指導、組織討論、總結匯報時，要花費幾倍于常規課程的時間。同時，大學教師還面臨著教學與科研工作的沖突，目前的評價體系更關注教師的科研成果，再加上目前對這種教學方法工作量的計算、教學效果評價難等問題，導致教師對研究性教學的投入不足，最終可能敷衍了事、草草收場，不能真正實現研究性教學的目標。這些問題的存在對大學管理模式的革新亦提出了更高的要求。
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【摘要】 體內藥物濃度（主要是血藥濃度）的測定是研究藥代動力學的前提，中藥及其復方的藥代動力學又是中藥現代化的關鍵組成部分，所以體內藥物濃度測定方法的發展是每個藥代動力學研究者都應該關注的課題。隨著先進儀器的開發和使用，體內藥物測定方法取得了重大進步。該文綜述了近年來中藥藥動學血藥濃度分析的方法，包括分光光度法，色譜法，免疫法，同位素法和微生物法，并介紹了它們的優缺點。
【關鍵詞】 分光光度法； 色譜法； 免疫法； 同位素法； 微生物法
中藥藥代動力學是近20年迅速發展起來的以中醫藥基本理論為指導，用藥物動力學方法研究中藥在動物或人體內的吸收、分布、代謝和消除過程的一門新興邊緣學科。血藥濃度法［1］是藥物動力學研究的經典方法，是計算藥代動力學最常用最準確的測定方法，所以血藥濃度準確的測定是中藥藥代動力學研究至關重要的環節。先進的測定方法是精確測定的前提，發展更先進、更合適的測定方法是中藥面向現代化、面向世界的必經之路。
1 利用原子和分子對不同激發光譜的吸收特性，來鑒別確定指標成分
1.1 分光光度法［2］
包括紫外-可見分光光度法，熒光分光光度法及原子吸收光譜法。分光光度法儀器設備簡單、投資少、成本低、操作方便，只要有一定吸收光譜的物質均能測得。曹蔚等［3］人用紫外分光光度法測定紅花黃色素在家兔體內的藥代動力學，結果表明：紅花黃色素在健康家兔體內為一室模型，主要藥動學參數：曲線下面積（AUC）為40 192.6μg·min-1·ml-1，半衰期為44.0min，消除速率常數為0.016/min，腎清除率為1.22ml/min。但分光光度法靈敏度較低，對體內許多內源性物質難以區分，所以分光光度法常與色譜法聯用，目前紫外分光光度法和熒光分光光度法被廣泛用作高效液相色譜儀的檢測手段。
1.2 色譜法
包括薄層層析法、薄層掃描法、氣相色譜法、氣相-質譜聯用，高效液相色譜法（單維、二維、三維、熒光）液相-質譜聯用。色譜法尤其是高效液相色譜法，經過多年發展已趨于完善，其穩定性、可操作性、準確性、靈敏度均有了較大的提高，成為色譜法的代表。
1.2.1 薄層層析法
層析法是分析研究中最常用的分離手段，薄層層析是層析分離中應用最為普遍的方法之一。周繼紅等［4］用HP-TLC法測定了血清中大黃有效成分的含量。薄層層析分離效率高，不易受溶劑和雜質的干擾，其缺點是線性范圍較窄，操作技術要求較高。
1.2.2 薄層掃描法
薄層掃描法系指用一定波長的光照射在經薄層層析后的層析板上，對具有吸收或能產生熒光的層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。對于中成藥復方制劑，亦可用相應的原藥材按需要組合作陰、陽對照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。使用儀器為薄層掃描儀。賀浪沖等［5］用固相萃取-薄層掃描法測定兔血清中青藤堿濃度，他們用自制硅膠萃取柱及萃取儀，將血清中青藤堿凈化后，點樣于硅膠G硅膠GF254（2∶1）薄層板上，以氯仿甲醇（19∶2）為展開劑，在島津CS-930上，用雙波長（λS275nm ，λR320nm）鋸齒法掃描測定。結果表明：血清中青藤堿的固相提取回收率為（96.95±7.59）%，用薄層掃描法測繪了兩只家兔靜注青藤堿后的藥物濃度-時間曲線，青藤堿的薄層掃描測定法靈敏、準確。
1.2.3 氣相色譜法（GC）
GC是一種高效能、高選擇性、高靈敏度、操作簡單、應用廣泛的分離分析方法。在生物堿的血藥濃度測定方面應用較多，如郭軍等［6］用GC-FID法測定人含服速效救心丸后血中冰片、川芎嗪含量。不同時間點取健康志愿者含服速效救心丸后的血漿并分別測定其冰片、川芎嗪濃度，經3P97軟件處理數據得其藥動學參數。測得健康人血漿中兩種成分線性范圍為20～420 ng/ml，線性關系良好，健康人含服速效救心丸后血漿中體內藥時過程符合開放性一室模型，吸收、分布、排泄較為迅速。但GC法受樣品揮發性的限制，實際應用的比例很小。
1.2.4 氣相-質譜聯用（GC-MS）
GC-MS聯用分析的靈敏度高、特異性強、實驗簡單高效，適合于低分子化合物分析，尤其適合于揮發性成分的分析，特別在中藥揮發性成分的鑒定等方面。如楊赴云等［7］用氣相- 質譜聯用法測定大耳白兔中銀杏內酯的血藥濃度，計算其藥代動力學參數，結果表明：大耳白兔靜脈注射銀杏內酯A、B后代謝符合二房室模型。
1.2.5 高效液相色譜法（HPLC）
高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）是在20世紀60年代末期，在經典液相色譜法和氣相色譜法的基礎上發展起來的新型分離分析技術，其采用高效固定相，以高壓輸送流動相，并配有各種檢測器，使分離與測定組成一個統一系統。HPLC法具有適用范圍廣、分離效能好、分析速度快、流動相可選擇范圍寬、靈敏度及特異性高、高度自動化等優點，自20世紀80年代用于中草藥藥代動力學研究以來，現已成為中藥藥代動力學研究的主要手段［8］。其中反相高效液相色譜因條件溫和、分離度好、適應性廣、樣品前處理簡單、靈敏度高等優點，在實踐中被廣泛應用。一般應根據目標成分選擇不同的檢測器，最常用的是紫外-可見光譜檢測器，若采用電化學或質譜作檢測器則可使靈敏度提高幾個數量級，但儀器過于昂貴限制了使用。
如李向陽等［9］采用 RP-HPLC法測定大鼠血漿中龍膽苦苷藥物濃度，色譜柱為 Lichrospher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（33∶67，V/V），結果表明：在1～20 mg/L范圍內龍膽苦苷峰面積與濃度線性關系良好（r=0.999 7），最低可定量濃度為0.03 mg/L，絕對回收率為88.4%～96.2%，準確度為97.8%～104.9%，日內、日間RSD均小于10%。Kontani A等［10］用HPLC-ED測定大鼠體內黃芩苷和黃酮的血藥濃度，結果顯示黃芩苷和黃酮的血藥濃度與注射劑量分別在2.2 pg～4.5 ng，1.4 pg～2.7 ng范圍內線性關系良好。
孟憲生等［11］采用HPLC-FLU法研究家犬血漿中羌活提取物異歐前胡素的藥代動力學，采用藥代動力學軟件DAS（ver2.0）處理，得到異歐前胡素的藥代動力學參數。色譜柱為Phenomenex ODS（4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈-0.025 mol/L磷酸水溶液（1∶1）；流速為1.0 ml/min；熒光檢測Ex=310nm，Em=480nm。結果表明：異歐前胡素在家犬體內的代謝過程符合一室模型，吸收消除較快。
1.2.6 高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）
HPLC-MS聯用是將高效液相色譜儀與質譜儀用界面連接成一個完整的儀器，實現在線檢測［12］。HPLC-MS法具有高度的專屬性，對多數藥物的檢測靈敏度超過其他分析方法，使定量測試速度顯著加快，可以對混合物中的微量組分進行分析，已成為藥物分析中的主流技術。如張蕾等［13］用HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的濃度及其藥代動力學，血漿樣品經氯仿液-液萃取后，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（10:90）為流動相，用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）分離，采用電噴霧離子化源（ESI）單重四極桿串聯質譜，以選擇離子檢測（SM）方式進行檢測。該法快速、靈敏、專屬、適用于同時測定生物樣本中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的血藥濃度。
HPLC-MS聯用法對不同的藥物分子，隨著離子化程度的難易其檢測靈敏度存在很大差異。對有機堿藥物的靈敏度最高定量限可達ng/ml或更低；對酸性、中性藥物的靈敏度依次降低；對烴類化合物則沒有信號響應，這是該法應用的最大局限［14］。
2 免疫分析法
免疫分析法的基礎是免疫反應，即抗原與抗體結合，形成抗原－抗體結合物。這種結合是疏松、可逆的，利用樣品中待測藥物與標記藥物之間的競爭，使標記藥物從標記的抗原－抗體結合物上被取代，其取代量與加入的待測藥物的量相關，通過測定被取代的標記藥物來定量分析待測藥物。主要包括放射免疫法和酶聯免疫法。免疫法有較高的靈敏度和準確性，操作簡單，適用于對大分子物質的檢測，但對于許多內源性相似物質的辨別能力有待提高。曲靜偉等［15］采用自動熒光偏振免疫法測定血清中地高辛的濃度，結果表明：在成年患者中84.6%例次的血清地高辛濃度在有效治療范圍（0.5～2.0 ng/ml），7.5%例次超過中毒濃度，7.9%例次低于最低有效濃度。可以得到對于腎功能正常或基本正常的成年患者，地高辛的日劑量不宜大于0.25 mg/d。
2.1 放射免疫法（RIA）
放射免疫法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發生競爭性抑制反應的方法，研究機體對抗原物質反應的發生、發展和轉化規律。RIA靈敏度高，專一性強，取樣量少，簡單易行，可廣泛用于體液及組織微量激素、蛋白質、維生素和藥物等的測定。在中藥藥代動力學的測定中也有較好的應用。如劉曙光等［16］應用了放射免疫測定法來測定口服黃夾次苷甲、乙和黃夾苷后的藥代動力學。
2.2 酶聯免疫法（EIA）
［17］EIA由于標記物的多樣性，使其應用范圍更廣且無同位素污染。在均相酶免疫測定中，因不需分離使操作更方便、快速，廣泛用于抗生素、抗癲癇藥、平喘藥、心血管系統藥等多種藥物的測定和藥物濫用的監測。
3 同位素標記法
同位素標記法（Isotopic tracer method）是利用放射性核素（或穩定性核素）作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法。同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩定性核素）及它們的化合物，與自然界存在的相應普通元素及其化合物之間的化學性質和生物學性質是相同的，只是具有不同的核物理性質。因此，就可以用同位素作為一種標記，制成含有同位素的標記化合物（如標記食物，藥物和代謝物質等）代替相應的非標記化合物。
3.1 放射性同位素標記法
利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內或體外的位置、數量及其轉變等，放射性同位素與其它測定方法聯用可以很好的完成中藥代謝產物在體內的血藥濃度測定。用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏，測量方法也簡便易行，能準確地定量，定位且符合所研究對象的生理條件等特點，但放射性同位素法對環境有污染，因而實際應用較少。
3.2 穩定性同位素標記法
穩定性同位素雖然不釋放射線，但可以利用它與普通相應同位素的質量之差，通過質譜儀，氣相色譜儀，核磁共振等質量分析儀器來測定。但穩定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低，可獲得的種類少，價格較昂貴，其應用范圍受到限制。
4 微生物法［18］
具有抗菌活性的中藥復方制劑，如黃連解毒湯、清瘟敗毒飲、大黃牡丹皮湯劑等，可以利用微生物法測定體液樣品的濃度，然后擬合模型計算藥代動力學參數。潘嘉等［19］采用抑菌效應法測定川芎揮發油藥動學參數，結果表明：川芎揮發油的藥動學過程符合一室開放模型。
上述測定方法多是對中藥有效成分的血藥濃度測定，在某些情況下，有效成分可以代表中藥復方，但大多數情況下中藥復方中的成分復雜且不清楚，單一成分不能完全代表其作用。現在有很多人測定多種單體成分的血藥濃度以避免脫離中醫藥整體觀念思想，但是這種方法耗時耗力也并不一定能代表所有成分。為了更好的研究中藥復方的藥動學，中外學者提出了很多假說［20］，比較有代表性的有“證治藥動學”新假說［21］，“復方效應成分動力學”新假說［22］，“辨證藥動學”假說［17］，“中藥胃腸藥動學”［17］和“血清藥理學”［23］等。但這些假說都比較片面，不能全面的說明問題。
研究中藥制劑的藥動學是中醫藥發展的趨勢，對推動中醫藥學科的發展，促進中藥現代化和中藥走向世界具有極為重要的意義。為了能更好地為中藥藥代動力學服務，發展更高效、更靈敏的測定方法勢在必行。
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【關鍵詞】 龍血竭;含藥血清;蛋白沉淀
龍血竭為傳統中藥,是龍舌蘭科植物劍葉龍血樹[Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen]含樹脂木材的乙醇提取物[1]。龍血竭總黃酮(sanguis draconis flavones,SDF)是從龍血竭中提取得到的主要成分[2],包括黃酮、二氫黃酮、黃烷、查耳酮、二氫查耳酮等20多種化合物[3]。動物實驗表明,龍血竭總黃酮能對抗整體動物心肌缺血損傷[2]。本實驗將龍血竭HPLC圖譜征峰較明顯的5個成分的峰面積作為檢測指標(其中2個主要成分為龍血素A和龍血素B),以龍血竭原溶液為對照計算體外加樣后提取百分率,進行血清處理方法的研究。
1、儀器與試劑
Waters高效液相色譜儀:515 HPLC泵,2487雙波長吸收監測器,N2000雙通道色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所);TDL802B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);超聲儀(上海超聲波儀器廠);TU1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);ZH2 BLENDER渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠)。
廣西產龍血竭(廣西中醫學院制藥廠提供);龍血素A、龍血素B對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);乙腈(色譜純);甲醇,乙酸乙酯,丙酮,正丁醇,乙醚,三氯甲烷,正戊醇,95%乙醇,無水乙醇,三氯醋酸,均為分析純;新西蘭大耳白兔(廣東省醫學實驗動物中心提供)。
2、HPLC法的建立
2.1色譜條件
色譜柱:Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);保護柱:Easyguard C18 Replacement Cartridges Cat#6101;流動相:乙腈1%冰醋酸(體積比38∶62);檢測波長:280 nm;流速:1.2 mL/min。
2.2溶液的制備
取龍血素A、龍血素B對照品適量,用甲醇分別配制成每1 mL含10 μg的溶液,作為對照品溶液。
取廣西龍血竭,用甲醇配制成每1 mL含2 mg的溶液,0.45 μm微孔濾膜濾過,續濾液作為供試品溶液。
2.3線性范圍
將龍血素A對照品溶液分別配制成濃度為0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125 μg/mL的溶液,進樣10 μL,記錄色譜圖,進樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為:A=45 064 451m-10 379 768,r=0.999 2,線性范圍為9.25~231.25 ng。
同上,將龍血素B對照品溶液分別配制成濃度為0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675 μg/mL的溶液,進樣10 μL,記錄色譜圖,進樣量(m)與峰面積(A)的回歸方程為:A=33 227 615m-10 135 858,r=0.999 0,線性范圍為9.47~236.75 ng。
2.4穩定性試驗
取“2.2”項下的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、24 h進行檢測,分別記錄5個特征性成分的峰面積,相應峰面積的RSD值分別為1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%,即供試品溶液在24 h內保持穩定。
2.5供試品溶液HPLC圖譜
取“2.2”項下的供試品溶液,龍血素A、龍血素B對照品溶液及空白血清樣品,各進樣10 μL,記錄HPLC圖譜,見圖1。
圖1供試品溶液(A)、龍血素A對照品(B)、龍血素B對照品(C)及空白血(D)HPLC圖譜 略
含中藥龍血竭的血清處理方法研究在供試品溶液圖譜上選取5個特征峰較明顯的成分作為檢測指標,保留時間分別為10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min,其中峰4和峰5經驗證,確定為龍血素A(4′羥基2,4二甲氧基二氫查耳酮)和龍血素B(4′羥基2,4,6三甲氧基二氫查耳酮)[4],峰1、2和3結構未知。由上圖可知,空白血清樣品無干擾。
3、結果與討論
3.1提取率的計算
特征性成分的提取率=血清樣品征性成分的峰面積/供試品溶液相應成分的峰面積×100%
3.2血漿樣品的處理方法
3.2.1蛋白沉淀劑的選擇
實驗中發現,供試品溶液與10%三氯醋酸會發生反應,出現混濁現象,故使用常用的蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇、丙酮進行處理。
由兔耳緣靜脈取血約2 mL,置離心管中,加入供試品溶液1 mL,渦旋混合,分別加入各種蛋白沉淀劑甲醇、乙腈、無水乙醇和丙酮適量,離心,取上清液,水浴揮干后精密加入1 mL甲醇,超聲溶解,0.2 μm微孔濾膜濾過,取續濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照,計算得各成分的提取率見表1。
表1不同蛋白沉淀劑制備含藥血清的特征峰的提取率 略
從表1可見,以甲醇作蛋白沉淀劑對5個特征峰的提取率均較低,丙酮次之,乙腈和無水乙醇相對高一些,但對峰3的提取率均低于50%,證明4種處理過程均無法避免血漿蛋白對藥物的吸附,無法達到理想的提取效果。
按上述實驗步驟,在分別加入蛋白沉淀劑后,加入與血樣同等量的乙酸乙酯,提取3次,渦旋混合,離心,取乙酸乙酯層,合并提取液,水浴揮干,精密加入1 mL甲醇,超聲溶解,經0.2 μm微孔濾膜濾過,取續濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照,計算得各成分的提取率見表2。
從表2可見,含藥血清在使用不同蛋白沉淀劑后,通過同種有機溶媒——乙酸乙酯進行提取,可不同程度提高5個特征性成分的提取率,以無水乙醇組提高效果最不明顯,甲醇、乙腈、丙酮組均有顯著提高,且乙腈組對5個特征峰的提取率均達到80%以上。
表2不同蛋白沉淀劑與溶媒結合提取制備含藥血清的特征峰的提取率 略
3.2.2提取次數的選擇
使用乙腈作為蛋白沉淀劑,加入與血樣同等量的乙酸乙酯,分別按2、3、4次進行提取,水浴揮干后精密加入1 mL甲醇,超聲溶解,0.2 μm微孔濾膜濾過,取續濾液10 μL進行HPLC檢測。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照,計算得各成分的提取率見表3。
表3不同提取次數制備含藥血清的特征峰的提取率 略
由表3結果可見,使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次(見圖2)的效果明顯優于提取2次,當提取次數為4次時,對各特征性成分的提取率影響則較小,再增加提取次數意義不大。
3.2.3提取溶劑的選擇
使用乙腈作為蛋白沉淀劑,采用其他種類提取溶劑如正丁醇、乙醚、氯仿對血樣進行處理。以供試品溶液5個指標性成分的峰面積為對照,計算各成分提取率見表4。
圖2含中藥龍血竭血清HPLC圖譜 略
表4不同提取溶劑制備含藥血清的特征峰的提取率 略
正丁醇對于峰2、4、5的提取率達到80%以上,但對峰1和3的提取率均低于75%;而乙醚和氯仿對峰3的提取率均低于50%,不及使用乙酸乙酯為提取溶劑的效果。
4、結 論
將含中藥龍血竭的血清先通過乙腈沉淀血漿蛋白,再使用與血樣同等量的乙酸乙酯提取3次,可使龍血竭中5個特征性成分的提取率達到80%以上。本研究結果可為中藥龍血竭的體內藥動學研究提供依據。
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[關鍵詞] 數理統計方法；配伍優化；配伍規律；配伍禁忌
[收稿日期] 2013-12-26
傳統中醫臨床用藥的主要形式和手段是方劑，而方劑的本質是各組分間的配伍。方劑配伍規律研究的內容主要是依據中醫藥基礎理論，為達到防治疾病目的，而將兩味或兩味以上具有一定協同或拮抗作用的中藥配合應用的藥物間聯系或內在規律。方劑配伍規律內涵的揭示是中醫藥現代化的要求，同時也是中醫藥走向國際化的必備要素，可為我國獨立自主的知識產權與專利保護提供有力的科學依據。近年來，越來越多的現代科學技術和方法應用于中藥復方配伍規律的研究，如復方配伍前后、不同配伍方法下藥物化學成分[1-4]、藥理作用[5-7]的變化規律和機制；采用血清藥理學實驗，揭示中藥復方在體內發揮療效的活性物質[8-10]；復方藥物在體內的代謝規律[11-13]；中藥復方譜效關系研究[14-15]等。而運用數理統計、數學模型等方法作為定量化分析與推斷數據資料、探究事物內在規律的手段，從數學關系的角度對復方配伍規律進行闡述，既有助于科學認識復方配伍的實質，也有助于中藥新藥復方科學化組方，在揭示中藥復方配伍規律內涵的研究方面起到了重要的作用。
目前對中藥方劑配伍規律的數理統計實驗研究主要集中在：數據處理和實驗研究兩方面。其中數據處理包括：數據挖掘、聚類分析、因子分析、主成分分析、相關分析、回歸分析、方差分析等；實驗設計包括：全方研究、撤藥研究、直接實驗設計、單味研究、藥對研究、正交設計法、均勻設計、析因設計法、正交與均勻聯合設計法等。利用現代數理統計理論方法與技術研究中藥方劑配伍規律和內涵，一方面可以促進處方配伍配比的優化篩選，充分提高中藥材的藥物療效，另一方面還將促進我國中醫藥事業走向現代化國際化，使中藥方劑更易于被國際醫藥界所接受。本文就數理統計方法在中藥復方配伍研究中的應用，從方藥配伍劑量優化、中藥配伍作用規律、中藥配伍禁忌規律等方面進行綜述。
1 方藥劑量配伍優化研究
方劑療效是復方藥物相互作用所表現的綜合結果。其中，影響方劑療效的兩大因素是復方的藥味組成與藥量配比。復方劑量配比優化不僅可以對處方藥物進行優化篩選，提高藥物療效，同時也是中藥新藥開發的重要任務之一。基于此需求，許多學者利用不同的數理統計方法對中藥劑量配伍優化進行了較多的研究。
1.1 實驗設計方法
1.1.1 正交設計法 正交試驗設計是為尋求最優化水平組合的一種高效的多因素實驗。其特點表現在不僅消除了各效應間的相關性，使得藥物各因素及其交互作用對指標的影響大小和變化規律更易于估計，即正交性；而且可以通過部分試驗的結果反映全面實驗的情況，便于數據結果的分析，即代表性。基于這兩方面的特點，正交設計試驗已被廣泛應用于中藥復方的組分優化篩選等方面。趙學軍等[16]采用正交設計法對溫腎咳喘片各組分的最佳劑量配伍進行了研究，得出其提取物的最佳配比為厚樸-蛇床子-甘草提取物4∶3∶3，并且按此比例制成的制劑有明顯的藥理作用，說明該組方劑量合理。張萬龍等[17]采用正交試驗對澤瀉湯加味方進行最佳組分配伍研究，結果得出了澤瀉湯加味方最佳降壓效果的最優藥用劑量為澤瀉 21 g，炒白術 9 g，澤蘭、石菖蒲各15 g。姚干等[18]采用正交設計法配合多藥效指標綜合評價，篩選出具有保肝和免疫調節作用的二至丸有效部位群組方，其最佳劑量比為女貞子總皂苷-女貞子多糖-墨旱蓮黃酮 58∶367∶18（質量單位以mg計）。汪珊珊等[19]基于正交試驗對由麻黃、杏仁和甘草三味藥組成的三拗湯進行了最優配比的研究，結果最佳配比為麻黃6 g，杏仁9 g，甘草3 g，其主次關系為麻黃>杏仁>甘草，表明優選配比三拗湯對哮喘模型各指標均表現出明顯的改善作用。此外，許多學者[20-26]還采用正交設計試驗對復方藥物劑量配伍進行實驗研究與數據處理，從而優化藥味和藥量的最佳配比，以一個新的角度為劑量配伍優選從飲片配伍研究過渡到組分配伍研究提供了數據依據和方法參考。然而，相比于復方劑量配比優化的特殊要求，目前的正交設計試驗還未能實現多目標優化，并同時具備良好的非線性擬合能力以及完善的試驗設計方法，僅限于研究藥味組成較為簡單的處方，這對復方優化的效果及其優勢的發揮都造成了一定的影響。
1.1.2 均勻設計法 相比于為了實現整齊可比性而導致每個因素的各水平必須重復，從而使得試驗點相應增多的正交設計法而言，同樣作為一種篩選研究手段的均勻設計方法，在實驗過程中僅考慮實驗點的均勻分散性，因而不會受因素數、因素水平的限制，實驗次數可明顯減少，而不導致試驗所反映的信息量減少，適用于多因素多水平的試驗研究。均勻設計法近年來被學者廣泛應用于復方劑量配伍優化實驗研究。興等[27]采用均勻設計法對降尿酸方主效應中藥的最佳配伍進行研究探討，實驗結果顯示黃柏、秦皮及桑寄生三味中藥組合是降尿酸的最佳配伍組合，而且實驗明確了其最佳的劑量配伍分別為50，260，50 mg?kg-1。唐亞軍等[28]通過均勻設計法對防治脂肪肝的復方中藥“祛濕化瘀方”有效組分或單體（綠原酸、梔子苷、姜黃素、虎杖苷、白術多糖）進行篩選和驗證研究，結果表明運用均勻設計篩選獲得的組分方（梔子苷、綠原酸）對高脂飲食誘導的大鼠肝臟脂肪沉積及肝損傷具有顯著的防治作用。賀燕等[29]采用均勻設計法探討三七及山楂組合物中有效部位的最佳劑量配伍，實驗結果得出山楂葉總黃酮與三七葉總皂苷的最佳組合比例為20∶15，并且在此條件下藥效作用明顯，說明運用均勻設計與藥理學動物模型相結合的方法對中藥復方進行研究是可行的。曾曉會等[30]采用均勻設計法尋找姜黃素與胡椒堿的最佳配比，結果顯示在姜黃素為13 mg?kg-1和胡椒堿為5.81 mg?kg-1時可使姜黃素和胡椒堿有最大的降三酰甘油效應。高鵬等[31]應用均勻設計處理方法對丹心痛各味藥所占比例進行篩選，從而確定川芎、香附、冰片、丹皮酚4種成分在復方中的最佳配比為5∶1.7∶1.4∶4.4（原提取物的質量比），劑量為138 mg?kg-1（折生藥2.78 g?kg-1），證明均勻設計作為有效優化復方最佳劑量方法的可行性。基于均勻設計法可以更全面更充分地優化復方中劑量配伍的關系，許多學者都在這方面做了很多研究[32-37]，這為我國現代中醫藥優化劑量配伍研究提供了很好的篩選手段與技術支持。雖然均勻設計法在一定程度上克服了早期試驗設計的諸多弊端，明顯減少了試驗次數，提高了實驗效率，但其僅考慮了均勻分散性，并沒有以正交性與代表性為基礎，因此可能造成試驗結果不穩定及導致分析誤差增大。
1.2 優化方法
響應面方法作為優化的常用工具[38]，是研究實驗結果與實驗因素關系的方法，包括實驗、建模、數據分析和最優化過程。目前響應面設計多與正交設計、均勻設計、星點設計、Doehlert設計、Box-Behnken 實驗設計等聯合應用在方藥劑量配伍優化方面的實驗研究中。謝臻等[39]應用Doehlert設計-渴求函數-響應曲面優化法，研究枳實、厚樸和芒硝的劑量配伍變化對大黃蒽醌類成分在大承氣湯中溶出的影響，結果顯示方中各味藥劑量配比為大黃-枳實-厚樸-芒硝1∶4∶2.31∶2時，蒽醌類成分有較好的溶出率。這是Doehlert數學模型運用到中藥復方配伍研究的初步探討，為數學模型在中藥復方配伍的推廣和應用提供理論依據。黃美艷等[40]應用響應曲面分析法對不同制法與配比的藥對當歸-川芎的抗氧化活性作用進行研究，結果表明先水提后醇提其清除自由基的活性最好。邱玲玲等[41]以流感病毒神經氨酸酶活性抑制率為指標，采用Box-Behnken響應面設計法預測雙黃連注射液組合成分的最佳配比。結果表明其最優配比為綠原酸-隱綠原酸-咖啡酸-黃芩苷107∶279∶7.99∶92。黃美艷等[42]采用響應面分析法對不同濃度當歸-川芎藥對配伍養血補血效應進行研究，結果顯示當歸與川芎的比例從4∶1到2∶1，從小劑量到大劑量，均表現為相加作用。而其他比例則表現出小劑量相加，大劑量協同的作用。陳海燕等[43]采用響應面法對丹參葛根的最佳組合比例進行了研究探討，結果顯示丹參葛根的最佳組合比例為6∶4。王睿等[44]采用實驗設計（ED）-非線性建模（NM）-多目標優化（MO）的三聯法，簡稱ED-NM-MO三聯法，對經基線等比增減設計的丹參、三七不同配比的藥效學數據進行非線性擬合和多目標優化，從而實現方劑劑量配比的非線性多目標優化。結果表明，可以根據實驗目的對藥效指標的不同要求設定不同的權重，獲得各自藥物相應的最優比例。這種適合復方特點的優化方法可用于多飲片多組分多成分復方藥物的劑量配比優化。
此外，鑒于星點設計-響應面優化法有著操作簡單、試驗精度高、實驗次數少等優點，其在工藝優化提取[45-48]以及制劑、食品、生化等[49-56]方面都有著廣泛的應用，在藥學領域有著較好的推廣應用價值。
1.3 數據處理方法
數據處理是對數據的采集、存儲、檢索、加工、變換和傳輸。常用的數據處理方法有數據挖掘[57]、回歸分析[58]等。數據處理方法可以從大量的、雜亂無章的數據中抽取并推導出特定的有意義的數據。基于此功能，許多學者都將數據處理方法應用于方藥劑量配伍優化試驗研究中。蔡文選等[59]應用化學計量學分辨方法-交互移動窗口因子分析法，對桂枝-茯苓配伍后揮發油成分中的共有成分、差異成分及各成分溶出率進行比較分析。結果顯示少數組分配伍后溶出率顯著增加，但大部分溶出率明顯下降，甚至個別組分消失。這表明藥對配伍后會改變其劑量。李偉霞等[60]基于人工神經網絡法對當歸-川芎藥對中主要效應物質含量與其整合效應值進行擬合和分析，結果表明當歸-川芎藥對1.5∶1水提物的整體補血效應最好，1∶1醇提物的總活血化瘀效應最好，1.5∶1醇提物的總調經止血效應最好。蔣海強等[61]以鉤藤總堿和萊菔子總堿有效組分的降血壓效應為研究對象，采用偏最小二乘回歸分析方法，探討鉤藤總堿和萊菔子總堿的最佳配比，結果顯示鉤藤總堿25 μg?g-1和萊菔子總堿30 μg?g-1時得到最佳配比。表明采用正交設計結合偏最小二乘回歸分析的方法，能夠消除各因素的交互作用，可用于中藥的組分配伍及優化設計。施旭光等[62]采用非線性回歸法分析不同劑量配伍所導致的烏頭湯化學成分變化的內涵。顯示不同劑量配伍的烏頭湯各藥味間主要存在非線性的關系，各因素間存在交互效應，不同的優化目標有不同的最優化配伍組合。商洪才等[63]應用多目標模糊優化法對丹參、三七不同劑量配比組合治療實驗性急性心肌缺血犬的數據進行處理，結果觀察到丹參、三七在最優配比10∶1和10∶3時可明顯改善模型犬的病變，同時，丹參、三七適宜的配比效果在整體調節功能上優于2種藥的單獨應用（10∶0，0∶10）。
雖然目前應用數學方法對方藥劑量配伍優化的研究越來越多，但是試驗研究方法中還沒有能夠充分利用數理統計方法的優勢對中藥復方藥味組成與藥量配比優化給予中肯的評價，同時數理統計方法本身存在的不足也未能很好的揭示方劑配伍內涵。因此，無論從試驗方法上或是對數學方法本身都有待進一步完善。
2 中藥配伍作用規律研究
中藥方劑并不是幾種或幾十種藥物的簡單堆砌，而是依據藥物各有所長的功用，在辨證、立法的基礎上選藥配伍而成并發揮整體增效減毒調節作用，使各具特性的群藥組合成一個新的有機整體。方劑經過配伍必然使得復方成分變得更加復雜。為了更全面、深入地研究與數學特征相適應的中藥復方配伍藥理作用和化學變化之間的相關規律，許多學者在研究復方配伍作用規律的實驗中引入了數理統計方法。
2.1 藥理作用變化規律研究
藥理實驗是檢驗藥物配伍藥效的途徑之一，其中中藥藥理包括整體、器官、細胞和分子4個水平。應用藥理學的方法結合數學模型去探討中藥配伍的變化規律已有較多文獻報道。余林中等[64]通過運用正交設計法對葛根芩連湯各配伍與解熱藥效之間的關系進行研究以探討其配伍規律。結果顯示對于解熱指標最佳的配伍是葛根黃芩。任均國等[65]構建以中藥為節點，中藥配伍關系為邊的網絡理論，將網絡效能與不同配伍方劑的藥效進行直線相關分析，采用急性心肌缺血再灌注損傷大鼠模型研究加味生脈散中兩兩藥物配伍規律，結果優化出藥效最強、藥味數最佳的方劑為4味方最高的是人參+麥冬+丹參+延胡索，三味方最高的是人參+丹參+延胡索。馬秉亮等[66]應用正交設計法對瀉心湯不同配伍抗炎作用進行研究，結果顯示在抗炎方面，大黃是方中的第一要藥，黃芩次之，且兩者有協同作用，而黃連沒有明顯作用和影響。萬海同等[67]通過由麻黃、桂枝、杏仁和甘草組成的麻黃湯對16種誘導的SD大鼠，出汗，緩解痙攣的豚鼠氣管平滑肌，減輕疼痛與ICR小鼠動物模型組和正常對照組進行比較。基于結構方程模型，對中草藥的路徑圖的繪制，用阿摩司（Amos）軟件和4個中藥和治療效果的關系進行了測定，分析了結構方程模型的相關關系。根據測量的標準通徑系數結果確定了麻黃湯中的君藥為麻黃，臣藥為桂枝，佐藥為杏仁，使藥為甘草。說明結構方程模型可從一個全新的角度用于定量分析中藥復方方劑組成原理。
以中醫藥傳統理論為基點，將數理統計方法理論與技術結合藥理學實驗對方劑配伍規律進行研究，通過對實驗結果進行統計分析與綜合評價，探討復方中藥味配伍與藥理效應變化的相關性規律，有助于對方劑配伍規律進入更深層次的研究。
2.2 化學成分變化規律研究
中藥數學模型的研究對象除了中藥藥理，還包括中藥化學。方劑中各藥味具有多部位、多組分、多成分的特征，是一種特殊的化學混合體，中藥的配伍使化學成分變得更加復雜。如何全面揭示復方中藥化學在全方、有效部位、有效組分和有效成分4個層次上的配伍規律是目前需要解決的問題，許多學者利用數學方法對此難題進行了較多的研究。李姝臻等[68]采用均勻設計法對黃芪桂枝五物湯中黃芪、桂枝、大棗、生姜與白芍不同劑量配比中白芍總苷含量變化進行比較，結果表明復方配伍使白芍中白芍總苷的含量下降24.5%，生姜對其影響最大，占10.2% 。徐培平等[69]采用均勻設計-偏最小二乘回歸建模的方法，以小承氣湯和厚樸大黃湯配伍組分為研究實例，分析了復方藥物配伍規律和組方中各組分的相對關系。結果表明小承氣湯和厚樸大黃湯雖然都由大黃、厚樸、枳實三味藥組成，但兩方的藥味配伍比例不同，小承氣湯中大黃和厚樸效應最大，而厚樸大黃湯以厚樸為君，大黃、枳實為臣使。陶靜等[70]應用數據挖掘算法的頻繁模式增長（FP-Growth）方法分析四物湯類方和藥對、藥組內部的組成關系，探討四物湯的配伍規律。結果顯示獲得大于0.15置信度的四物湯配伍常用藥有甘草、人參、肉桂和茯苓。王偉光等[71]采用正交設計法結合高效液相色譜對麻杏甘石湯不同配伍煎液主要化學成分含量進行分析研究，并探討配伍對各化學成分含量的影響。結果顯示麻黃堿、偽麻黃堿及苦杏仁苷的含量于全方去甘草組中含量顯著降低，甘草次酸的含量于全方去杏仁組中也顯著下降，其余各組含量變化不顯著。周文俊等[72]應用偏最小二乘法對麻丸仁的2種劑型進行化學成分變化比較研究，結果發現2種劑型之間有差別的化學成分，最重要的主要來自枳實。還有部分學者利用主成分分析法和正交偏最小二乘判別法分析中藥藥對和方劑合煎液與分煎液中化學成分的差別，結果發現配伍合煎后化學成分的變化較大，應該是導致中藥減毒增效原因[73-75]。
中藥復方雖然療效確切但組分成分相當復雜，借助于數學方法對方藥配伍規律中化學成分的變化進行試驗研究不僅為復雜的配伍系統研究提供了有力的方法支持，同時也對方藥配伍規律內涵的揭示有著重要的現實意義。
3 中藥配伍禁忌研究
中藥理論中的“十八反十九畏”是目前中醫藥界共同認可的配伍禁忌之一。雖然歷代醫藥學家多遵信十八反十九畏作為配伍禁忌，但亦有醫藥學家認為相反藥同用，能相反相成，倘若運用得當，可產生較強的功效。近年來許多學者對十八反藥對配伍進行了較多實驗研究，尤其是結合了現代數理統計方法，觀察逐漸深入，對十八反配伍規律的認識也趨于客觀、準確。盧丹丹等[76]用定量藥理學方法評價甘遂與甘草不同比例組合對腸運動的影響，采用均勻設計法以小鼠腸推進率和腸質量為指標，觀察合并液和合煎液對腸功能的影響。結果表明：合并液可促進腸推進率，存在協同作用，兩藥合用大大增加腸推進功能。該研究為甘遂-甘草反藥組合的毒效表征奠定了一定的研究基礎。由此可看出，應用數理統計方法在一定程度上可以闡釋中藥十八反藥物毒效與配比及劑量的關系。劉春芳等[77]分別以制川烏與生半夏的藥理作用為觀察指標，采用均勻設計法對制川烏與生半夏的配伍藥效進行研究。結果表明制川烏與生半夏配伍比例為10∶1時，拮抗作用接近最大，能降低制川烏的鎮痛、抗炎作用。制川烏與生半夏為1∶1時合煎液對氣管酚紅分泌量的增加作用最明顯，能增強生半夏的祛痰作用，且其作用強度隨配比和劑量的不同而改變。王艷麗等[78]采用均勻設計法結合動物急性毒性實驗，探討藜蘆與細辛配伍的毒性規律。結果發現配伍后毒性并未隨藜蘆用量的增加呈嚴格的上升趨勢，毒性由藜蘆和細辛共同作用，且藜蘆對毒性的貢獻權重更大。當藜蘆用量是細辛用量3～6倍時，毒性明顯。當藜蘆給藥劑量低于臨床安全最高限時，藜蘆與細辛合用可視為安全的。當藜蘆與細辛合煎，藜蘆用量為5 g?kg-1時所產生的毒性大致與藜蘆單煎所產生的毒性一致。表明藜蘆和細辛配伍后毒性大小取決于兩者的比例和各自用量大小。朱冠秀等[79]采用均勻設計法對南沙參、北沙參與藜蘆不同比例配伍是否都產生相反毒性作用進行了研究，并考察了煎煮因素與毒性是否相關。結果顯示南沙參、北沙參與藜蘆配伍共同煎煮會使毒性增強，存在配伍相反的可能性。且在藜蘆給藥劑量相同的情況下，南、北沙參合并液毒性明顯低于合煎組，提示共同煎煮過程是影響配伍毒性的重要因素。這為南、北沙參反藜蘆之說提供了一定的實驗依據。
此外，還有許多學者[80-85]在這方面進行了相關的研究，對中藥十八反配伍藥效的變化及配伍禁忌的組成特點進行了探討，為相關的研究打下了一定的理論基礎。但同樣作為配伍禁忌的十九畏，雖然現代對其進行了較多較深入的研究，取得了不少成果，但應用數學方法對十九畏配伍特點進行研究的報道幾乎沒有。總的來說，目前應用數理統計方法對中藥十八反十九畏的配伍特點進行的研究還處于初期階段，揭示十八反十九畏藥對配伍規律的內涵還有待進一步的深入研究。
4 基于臨床處方配伍規律的研究
中藥方劑配伍研究的內容還包括基于臨床處方配伍規律的挖掘。通過將數學方法應用于臨床處方分析中，挖掘處方用藥的配伍規律，從而更好的指導臨床用藥。宋觀禮等[86]應用頻數分析、復雜網絡分析、點式互分析等方法對中醫診斷冠心病發病規律、癥狀規律、辨析規律、治法用藥規律進行數據挖掘分析。其中對于冠心病治法用藥規律的研究結果顯示，臨床治療冠心病的核心處方用藥為黃芪、黨參、丹參、當歸、川芎、茯苓、赤芍、瓜蔞、法半夏、麥冬、桃仁、紅花、陳皮、甘草。其中，桃仁-紅花的互信息積分最大（67.996 99），遠遠高于其他2個藥物間的互信息積分，是目前治療冠心病最常用的藥對。妮等[87]應用復雜網絡分析對李發枝教授治療艾滋病帶狀皰疹及其后遺神經痛的用藥規律進行研究，結果顯示治療艾滋病帶狀皰疹及其后遺神經痛的核心藥物為黃芩、甘草、紅花、車前子、全瓜蔞、當歸、龍膽草。核心處方為龍膽瀉肝湯加減和瓜蔞紅花甘草湯加減。杜斌等[88]基于數據挖掘方法對潰瘍性結腸炎方劑用藥及配伍規律進行分析研究，結果顯示方中白術、茯苓藥對應用的頻率最高，頻數112次。而甘草、白術、黃連、茯苓、白芍、木香、黨參、當歸、黃芪、陳皮是出現頻率最高的10味藥。這些研究工作不但對深入探討臨床用藥配伍規律及指導臨床用藥有重要的實用意義，且對于解放依賴傳統中醫主觀性較強的辨證論治和經驗水平的思維模式有著重要的指導意義。
5 小結與展望
中藥方劑多組分、多成分、多藥效的特點使得中藥復方配伍成為一個復雜的組方系統。從方藥配伍的劑量優化、中藥復方配伍的藥理效應、化學成分變化以及中藥配伍禁忌這幾方面進行實驗研究與探討，有助于對中藥復方進行更好的優化篩選和對組方藥物整體療效進行綜合評價，而且也在一定程度上體現了傳統中醫藥整體觀與系統論的思維模式。近年來，隨著各學科間的相互滲透相互影響，以及中醫藥走向現代化國際化的進程中，要求用精確的方式及準確的語言表達和描述中醫藥學，尤其對于如何全面、客觀、準確地揭示中藥復方的配伍規律顯得更為重要。如何找到更好的實驗設計方法和更好的數學擬合模型，如何更好的挖掘和發現復方中蘊含的豐富的配伍規律內涵，是值得深入探討研究的課題。
數理統計方法和計算機信息技術在醫藥領域中的應用，是現代科學技術迅速發展以及中藥事業自身發展的需要。數理統計方法通過對數據資料的搜集、整理、分析和推斷，探討設計試驗研究從而掌握事物內在客觀規律，具有數學化、定量化且準確簡捷的特點。將數理統計方法應用于中藥方劑配伍規律研究中，不僅可以將中藥方劑配伍定性與定量結合起來，用數學語言定性定量分析中藥復方配伍的相互作用規律，而且能夠做到客觀準確，更有利于藥物之間的優化篩選和進行藥效的評價。然而，數理統計方法在中藥方劑配伍規律的應用研究仍處于初始階段，一方面，中藥復方配伍在宏觀上涉及藥味的組合、劑量大小的變化以及藥物間的相互作用，微觀上牽涉到各化學成分的相互作用可能發生物理化學反應從而導致組分的改變，使得方劑配伍在多個環節上變得更復雜，這給全面準確地揭示方劑配伍規律的工作帶來了更高的難度。另一方面，相對而言，雖然數理統計方法能更好的輔助研究中藥方劑配伍規律，但目前的數學方法都在一定程度上存在著不足之處：首先，無論是方法上還是設計上都未能更好更完善的彰顯出數理統計方法的優勢從而導致無法更全面準確的揭示方劑配伍規律的內涵。比如析因設計法在因素增加的情況下，不但計算復雜而且難以解釋眾多的交互作用；正交設計法在多水平多因素的情況下試驗次數較多，工作量亦大；均勻設計法須回歸出與實際相符的定量方程式進行數據處理；響應面設計法得到的回歸方程要求自變量必須是連續的而且需要被試驗者自由控制；數據挖掘法要求試驗者能深刻理解其所應用的領域，以便正確選擇合適的模式進行試驗；模糊數學方法的設計更多的是依靠試驗者或專業人員的經驗和知識，當缺乏這樣的經驗與知識時，很難獲得滿意的實驗結果；偏最小二乘回歸方法的解釋矩陣中含有大量與響應向量無關的信息，可影響整個回歸的效果；等等；其次，只是簡單地套用數理方法和數學模型，還沒有能夠充分吸收和利用數理統計方法的理論成果和科技發展技術對中藥復方的劑量配伍優化給予全面、客觀、準確評價的試驗研究方法，沒有針對具體情況作改進，以適用于不同中藥復方配伍規律的研究。此外，將數理統計方法應用于臨床的研究較少[89-90]，為了深入地闡明臨床用藥機制以及更好的為臨床醫師根據病理診斷提供用藥參考，在數學方法的基礎上結合臨床特點進行深層次的研究還需要做出更大的努力。因此，在未來的方劑配伍研究發展中，如何以中醫藥理論為指導，同時引入數學模型，在現有的基礎上突破傳統思維進行技術改進和方法創新，是當前建立客觀科學技術研究中藥方劑配伍規律的關鍵。
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[關鍵詞] 藥劑學；案例式教學法；基于問題式學習法；探究式教學法；直觀教學法
[中圖分類號] R94；G642 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）05（c）-0126-03
藥劑學是藥學及相關專業的主干課程之一，是一門綜合性、實踐性均極強的學科。該課程所涉及的知識面廣，涵蓋內容多，應用性強，既需有多學科相關的理論知識，又需與實際密切聯系，這無疑對學生的學習和教師的教學都提出極大挑戰。因此，就更需要教師在教學中不斷創新教學方法，理論聯系實際，根據教學內容和要求，綜合應用與其相適應的教學方法，加強師生互動，才能取得更佳的教學效果。目前，在藥劑學教學改革中，我們嘗試將一些新的教學方法引入教學實踐，取得了一定的教學效果。
1 案例教學法的應用
案例教學法（Case-Based Teaching， CBT）是一種根據教學內容的要求，通過對典型案例剖析組織教學的方法[1]。這種教學方法最大的優勢是理論聯系實際，有利于提高學生聯系實際、分析問題、解決問題的能力。對于藥劑學這樣的一門實踐性、應用性強，理論與實踐并重的學科，采用這種教學方法往往可以起到事半功倍的效果[2-3]。
在講授“滅菌制劑與無菌制劑”一章時，我們選用了曾發生于本省的藥害“欣弗事件”為典型案例，以該案例為主線，組織、展開教學，既較好地闡明了教學內容、重點和難點，又激發了學生的學習興趣，加深了對基本知識點的理解記憶，起到了警示作用。
“欣弗事件”是一起典型的因未嚴格按生產工藝操作導致藥品不合格所產生的藥害事件。2006年8月，國內多地相繼發現，部分患者在使用了克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（商品名欣弗）后，臨床出現胸悶、心悸、寒戰、肝腎損傷、過敏性休克等癥狀，有多人死亡。經SFDA查證，這是由于廠家在生產中未嚴格按工藝參數滅菌，私自降低滅菌時間，增大滅菌柜載量，致使制劑滅菌、熱原等項檢驗均不合格所致。
在確定了教學案例之后，我們按以下方式組織了“滅菌制劑與無菌制劑”一章的教學。①預習教材：同學預習教材相關內容，重點了解注射液制備工藝過程及滅菌制劑安全性保障措施；②資料檢索：同學網上查閱“欣弗事件”及其他有關注射液安全事件的信息；③課堂討論：重點討論“欣弗事件”的主要教訓及保證滅菌制劑安全性的措施、意義；④教師評論：根據教學要求和討論中提出的問題，進行解答、概括、總結，以加深學生對相關知識的理解、掌握、記憶。
通過以該案例為主線展開教學，與傳統的單純講授教學法相比，不但較好地使學生掌握了滅菌制劑安全性保障措施，樹立了安全第一的觀念，理解了嚴格執行滅菌技術各項參數的重要意義，還極大提高了學生學習的積極性、主動性，引導學生拓展思維，舉一反三地應用知識。例如在討論中就有同學提到“亮菌甲素注射液事件”及“魚腥草注射液事件”等藥害教訓，使同學們從注射液的澄明度、輔料等各方面進一步認識保障滅菌制劑安全性的重要意義，并比照不同藥物特點，如氧化性、pKa等性質，分析工藝關鍵點，選擇更為適宜的制劑方案流程；另一方面，通過對實際案例的分析，加深了學生們對于比較枯燥、抽象的技術參數的理解，如熱原的危害及去除方法等。
2 基于問題式學習法的應用
基于問題式學習法（Problem-Based Learning， PBL）于上世紀50年代始用于醫學教育，現已成為一種較為多用的教學方法[4]。該法有益于營建主動、活潑的學習氛圍，引導學生帶著問題學習、思考，通過討論分析充分表達自己觀點，加深對知識的理解，培養學生學生分析問題、解決問題的能力，有利于克服、改變傳統的教師講、學生記為主的“填鴨式”刻板枯燥的教學模式[5]。
藥劑學是一門綜合性很強的應用學科，各類制劑介紹基本上按照配制理論制劑工藝技術要求質量控制合理應用的過程展開。若按傳統授課方法逐一講解，不僅會使學生感到內容繁雜、信息量過大，難以掌握重點內容，也會使講課內容單調，課堂氛圍沉悶，難以引起學生的興趣，影響教學效果。
藥劑學的固體制劑是重要的教學內容，常用劑型顆粒劑、膠囊、片劑等的制備工藝都有藥粉的混合、制粒、分劑量等過程，而這些過程都涉及粉體學理論。因此，粉體學理論是學習掌握的關鍵，自然應當作為固體制劑的教學重點；而教材中粉體學相關內容卻在“藥物制劑形成理論部分”中獨立成章，這就容易造成學生難以融會貫通，更因缺乏具體、直觀的實例而增加了對相關理論理解上的難度。
為此，我們采用了PBL教學法，在講完固體制劑的相關內容之后，向同學提出“粉體制劑有哪些特性？它們在固體制劑制備中有何種意義？”、“在固體制劑制備工藝和質量檢查等過程中的注意要點里，有哪些可以用粉體學相關理論來解釋和理解？”等一系列的問題，引導學生查閱資料，總結教材相關內容，開展討論交流，使同學們對粉體學的概念，粉體的特性如粒徑、形態、比表面積、密度、孔隙、流動性、濕潤性等以及微粉化技術在各類制劑中的應用等內容問題有了較為全面的認識。再經教師總結、概括，對討論中的疑難問題作重點講解，使學生在理解的基礎上，對固體制劑制備過程中易出現的技術問題及解決方法有了深入理解，對知識的應用起到融會貫通的效果，也使學生學會了在內容繁多的知識中，把握重點和關鍵知識的方法。對藥劑學中一些理論性較強、內容抽象難懂及涉及面較廣的章節，尤其是物理藥劑學相關的制劑形成理論等內容，如溶液理論、表面活性劑應用等，我們也試用了PBL教學法。在進行教學時，教師先提出相關問題，讓學生帶著問題進行課前預習、查閱資料、聽課、得出問題的初步答案，再通過討論交流，弄懂知識要點，加深對理論的理解，完善問題的答案。教師通過參與、引導討論，傾聽學生的見解，發現帶普遍性的疑難問題，在歸納總結中加以詳盡解答[6]。
3 探究式教學法的應用
藥劑學是一門應用性、實踐性很強的學科，當前該課程教學仍以課堂講授為主，因此，實驗教學對培養學生的實踐能力，提高教學質量就顯得尤為重要。但傳統的藥劑學實驗教學，內容陳舊，方法滯后，多數實驗項目屬于驗證性實驗，單調的操作程序和末試先知的實驗結果，不僅不能激發學生的熱情，調動學生的積極性、主動性，更無法啟發學生的思考，培養學生的創新能力。
探究式教學法（Inquiry Teaching）是一種近年受到廣泛關注的新教學法。該法旨在使學生在教師的指導下，通過親歷親為，進行科研式的探究性學習，在掌握知識的同時，體驗科學研究過程和方法，提高學習的能力、科研素質和創新精神[7]。該院在近年改革藥劑學實驗教學時，引入這種教學方法。在針劑制備實驗中，我們選用維生素C針劑制為實驗內容，該品種具有易氧化、不耐高溫，制備過程中易分解破壞的特點，在處方選擇、工藝流程設計等方面需要盡量減少成分的氧化[8]。針對這一關鍵點，我們在實驗中要求學生自己設計處方和實驗方案，在常用抗氧化劑中選擇最適抗氧化劑及劑量，確定滅菌工藝條件等重要內容，完成試驗設計書面方案，提交老師審閱，指出優劣，由學生自主完成實驗全過程。這種實驗一改“老師做，學生看”的沉悶局面，整個實驗完全由學生擔當主角，教師只適時地起引導、提示作用，充分發揮了學生的積極性和主動性。同學們都能在設計實驗方案時，認真復習理論課內容，認真檢索有關資料，通過小組討論集思廣益提出質量較高的設計方案。比如，很多同學都能理論聯系實際，認識到抗氧化劑的作用與溶液的pH值相關，維生素呈酸性，宜選擇偏酸性的抗氧化劑亞硫酸氫鈉。在實驗過程中，也能一絲不茍地完成每一個實驗步驟，并用“正交法”摸索出維生素C流通蒸汽滅菌的最佳條件（100 ℃，15 min），求出其降解速率常數。
初步的實踐表明，在藥劑學實驗教學中適當地應用探究式教學方法，能較真實地模擬實際工作場景、條件和方式，給學生預留下較大的思考、探究空間，使學生有機會在學習中實現動手―動腦―動口相結合，對提高學生的自主學習能力和創新意識，能起到傳統教學方法所難以達到的效果。
4 直觀教學法的應用
藥劑學是一門工科特色很強的課程，這對藥學專業理科學生有一定的難度，尤其是由于生活經歷的局限，使學生對教材中許多內容缺乏必要的感性認識，給教學帶來一定的困難。而增加直觀教學法（Visualization Teaching）運用的份量，為學生提供更多的感性素材，增加學生的感性認識，可較好的提高學生的理解能力。
首先，教學中我們盡量增加實物的演示。比如，講授藥物制劑時，將相關藥物制劑帶到課堂上，讓學生傳看，在通過簡要講解、比較可以使學生很容易掌握普通片劑、糖衣片、含片以及顆粒劑、粉劑等類似制劑的區別。在此基礎上，教師再分別講解劑型定義、特點、質量要求等。同時，還可有意識的指導學生閱讀制劑包裝上的標簽和藥物說明書，增加學生對藥物的全面認識。這樣既活躍了學習氣氛，也可提高教學效果。充分利用已有的制藥設備，是進行藥物制備工藝教學的可行的直觀教學法。面對壓片機、顆粒機、包衣機等講解片劑制備工藝，面對灌封機、真空泵等講解針劑制備工藝，可以更好地讓學生理解這些設備的結構、工作原理，從而全面理解制劑工藝的全過程。實物教學可以讓學生在掌握基本的感性的材料后，建立起正確的表象，進而通過比較、分析、綜合、抽象、概括成正確形象，才能更好理解事物本質和規律。一步沸騰制粒機、流化床干燥機等制劑儀器的演示教學，有利于學生更為直觀地理解藥劑新工藝的運用和新儀器的基本原理。
充分利用教學中的素材，應用圖片、視頻、動畫等形式，利用本校已建立的網絡資源，制備多媒體課件，是直觀教學的新發展趨勢。尤其是多媒體課件，集圖像、文字、聲音、動畫為一體，可以更形象、仿真地給學生以直觀的印象。例如，在教學中，我們把一些制劑的工藝流程如濕法制粒、壓片工藝等，及灌封機、滾動式包衣機、流化床制粒機等設備內部構造、運行機理等，以flas形式進行講解；對各種制劑的特點、輔料、工藝、質控等主要內容以圖表方式加以總結，以利學生比較、記憶。制備了多媒體課件，直觀、形象、生動，激發了學生學習興趣，拓展了他們的想象空間，降低了學習難度。
5 體會
初步的實踐，使我們體會到，新教學法具有傳統教學法所欠缺優勢，應用適當，對提高藥劑學的教學質量，深化教學改革，確有極大的益處。
①新教學法較好地確立了教學中的“學生中心地位”的理念，使師生關系、作用與傳統教學方法發生根本改變。學生由知識的被動接受者轉變為知識的探究者、加工者、應用者；而教師也不再僅是知識的灌輸者，而是教學的設計者、組織者、引導者。師生處于完全平等的地位。
②新教學法更著重在教學過程中構建開放的環境和活潑的氛圍，形成一種基于問題的、探究的學習方式。學生帶著問題預習功課、檢索資料、聽課復習，在探究中尋找答案，獲得成就感，從而調動他們的主動性，拓展視野，提高能力。
③新教學法更依賴于學生自主學習的欲望和能力，如預習中的閱讀思考能力，信息檢索中的總結分析能力，討論中的交流表達能力，操作中的動手能力，協作中的團隊精神等。新教學法有助于培養學生的“會學、會想、會做、會講”的能力，改善和克服了傳統教學造成的“高分低能”弊端。
但也應當看到，新教學法需具備一些必要的前提和條件。①新教學法尤其是PBL教學法和探究式教學法需在學生已經學習并掌握了相關專業知識之后才能實施，否則起不到應有的效果。②新教學法需組織者預先有嚴謹的設計，如案例的選擇應與教學內容密切相關并具典型性、針對性；PBL法中問題的提出，探究法中課題的選擇，應切合學生知識面的實際，過深、過淺均難以達到預期的目標。③新教學法要求組織者有較高的組織、指導、駕馭、總結教學過程的能力和技巧，才能使整個教學活動既生動活潑又不離教學主題；既發揮學生的想象力、創造力，又始終圍繞教學大綱的要求展開。
總之，新教學法應用對教師提出了新的挑戰和更高的要求，敦促我們不斷提高自身的業務水平，與時俱進，才能完成“傳道、授業、解惑”的任務。
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【關鍵詞】 數學 公理化方法 研究數學 作用
【中圖分類號】 G424 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1006-5962（2013）02（b）-0042-01
1 數學公理化方法概述
1.1 數學公理化方法的內涵
純形式公理化方法的特征是具有高度的形式化和抽象化，系統的基本概念、基本關系用抽象的符號表示，命題由符號組成的公式表示，命題的證明用一個公式串表達。一個符號化的形式系統只有在解釋之后才有意義。同時，作為一個符號化的形式系統，可以用來提供簡潔精確的形式化語言；提供數量分析及計算的方法；提供邏輯推理的工具。
公理化方法的具體形態有三種：實體性公理化方法、形式公理化方法和純形式公理化方法，用它們建構起來的理論體系分別為《幾何原本》、《幾何基礎》和ZFC公理系統。
1.2 公理化方法的基本思想
數學是撇開現實世界的具體內容來研究其量性特征形式與關系的。其結果只有經過證明才可信，而數學證明采用的是邏輯推理方法，根據邏輯推理的規則，每步推理都要有個大前提，我們不難想象到，最初的那個大前提是不可能再由另外的大前提導出的，既是說，我們的逆推過程總有個“盡頭”，同樣，概念需要定義，新概念由前此概念定義，必也出現這樣的情況最原始的概念無法定義。
因此，我們要想建立一門科學的嚴格的理論體系，只能采取如下方法：讓該門學科的某些概念以及與之有關的某些關系作為不加定義的原始概念與公設或公理，而以后的全部概念及其性質要求均由原始概念與公設或公理經過精確定義與邏輯推理的方法演繹出來，這種從盡可能少的一組原始概念和公設或公理出發，運用邏輯推理原則，建立科學體系的方法叫做公理化方法。
2 數學公理化方法的邏輯特征
2.1 協調性
無矛盾性要求在一個公理系統中，公理之間不能自相矛盾，由公理系推出的結果也不能矛盾，即不能同時推出命題A與其否定命題，顯然，這是對公理系統的最基本的要求。如何證明給定的公理系統的無矛盾性呢？若想通過“由這一公理系作出全部可能的推論并指出其中沒有矛盾”來證明是不可能的。
2.2 獨立性
獨立性要求在一個公理系統中，被選定的公理組中任何一個公理都不能由其他公理推出。獨立性其實要求的是公理組中公理之間不能有依從關系，若某一公理被其余公理推出，那它實質上就是一個定理，在公理組中就是多余的，所以，獨立性要求公理組中公理數目最少。
2.3 完備性
完備性要求在一個公理系統中，公理組的選取能保證由公理組推出該系統的全部真命題，所以，公理不能過少，否則就推不出某些真命題，這是關于完備性的古典定義。現代數學常借助模型的同構給公理系的完備性下定義，即如果公理系T的所有模型或解釋都彼此同構，就稱這個公理系是完備的。
在上述公理化方法的三個特征中，無矛盾性是最重要而又是非有不可的。獨立性從理論上講，從完美簡煉上講，應該要求，因為公理和定理在整個系統中處的地位不同，公理是出發點，定理是推出的，不能混在一塊。但是，獨立性要求有時可降低。現行中學幾何體系就放棄了這一要求。至于完備性，要求就大大放寬了；而且“從研究完備的公理系確定的對象轉向研究其公理系不完備的對象”被認為是現代數學的特征之一。
3 數學公理化方法在研究數學中的作用和意義
3.1 表述和總結科學理論
公理化方法使有關的理論系統化，把它們按照某種邏輯順序構建成一個系統，因而便于人們系統地理解知識體系，便于掌握理論的本質。它是應用演繹推理的基本方法，它為認識世界提供了演繹推理的模式，提供了一種理性證明的手段，它是表述科學理論一種比較完善的方法，它為各門科學提供了一種思想方法上的示范和有效的表述手段，有利于促進理論的完善和嚴格化。它賦與數學內在的統一性，有助于人們了解數學各分支、各部門之間的本質聯系。
3.2 完善和創新理論
公理化方法的應用要求一門科學的充分成熟：積累了一定數量的基礎知識，進行了一定的系統分析和研究，對該門學科知識結構有了較深入的理解。因此，實現公理化的過程也是深入研究理論體系的過程。采用公理化方法還可以發現和補充理論系統中的缺陷和漏洞。從而有利于完善已有理論，創建新的理論。
3.3 培養和熏陶人們的邏輯思維能力
數學學習，重要的不在于只是記住概念、公式、定理和法則，而在于學會如何去獲得這些知識，即學會正確地進行數學思維，邏輯思維正是數學思維的核心成分之一。邏輯思維能力是一種重要的數學能力。而公理化方法使邏輯思維在數學中的作用得以充分發揮，大大提高了數學教育的成效，實現高度的思維經濟，這無疑對培養和熏陶學生的邏輯思維能力有其十分重要的作用和意義。此外，由于公理化方法可以揭示一個數學系統和分支的內在規律性，從而使它系統化，這也無疑有利于人們學習和掌握。
4 結語
公理化方法是是建立某些抽象學科的基礎，是加工、整理知識，建立科學理論的工具，公理系統的形成是數學分支發展的新起點。公理化方法有助于發現新的數學成果，可以探索各個數學分支的邏輯結構，發現新問題，促進和推動新理論的創立和發展。對各門自然科學的表述具有積極的借鑒作用。同時公理化方法對于學生理解和掌握數學知識、數學方法及培養學生邏輯思維能力具有重要作用。公理化方法本身及其在數學理論和實踐應用中的巨大作用，隨著科學技術的發展還在繼續向前發展。
參考文獻
[1] 李文平.論數學公理化方法在數學發展中的推動作用[J].讀寫算，2010（16）.
